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本試劑盒采用獨(dú)特的組分，提取細(xì)胞及組織中的膜蛋白。特殊的溶液系統(tǒng)，在裂解細(xì)胞的同時(shí)，還可以選擇性低地分離提取細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞器膜蛋白。提取方法簡(jiǎn)單，可靠，快速，獲得的膜蛋白純度高，可用于SDS-PAGE電泳、Western Blot、免疫沉淀等后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每次可以提取10⁷個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞或200mg動(dòng)物組織。

儲(chǔ)存和穩(wěn)定性

 常溫運(yùn)輸，收到后，DTT在-20℃保存，其余組分4℃保存，一年有效。

注意事項(xiàng)：

          需自備PMSF。PMSF要在抽提前2-3分鐘內(nèi)加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。

          濃縮洗滌液需要去離子水洗滌后再使用。

          使用本試劑盒抽提到的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白均可直接用GBCBIO的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度或Lowry法測(cè)定蛋白濃度。

使用說(shuō)明：

1．準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣品：

A． 細(xì)胞

貼壁細(xì)胞：培養(yǎng)約2000-5000萬(wàn)細(xì)胞，用PBS洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞或用含有EDTA但不含胰酶的細(xì)胞消化液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，吸除上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。

懸浮細(xì)胞：培養(yǎng)約2000-5000萬(wàn)細(xì)胞，直接離心收集細(xì)胞，吸除上清，留下細(xì)胞沉淀備用。

B. 對(duì)于組織：

取約100毫克組織，用剪刀盡量小心剪切成細(xì)小的組織碎片

2．樣品洗滌：用適量的已稀釋的洗滌液洗滌樣品三次，每次3000rpm離心2min。

3．樣品裂解：在上述細(xì)胞或組織中加入1ml蛋白提取液（使用前加入PMSF，終濃度為1mM，與2.5μl DTT），4℃下用玻璃勻漿器手動(dòng)上下手動(dòng)勻漿30-50次�；蛘哂�  超聲波破碎細(xì)胞，每次30s，3-4次，每次間隔1分鐘，置于冰上冷卻。細(xì)胞破碎后應(yīng)經(jīng)鏡檢，細(xì)胞破碎率不小于70%，無(wú)明顯的組織塊。

鏡檢：通常可以在勻漿30次后取約2-3微升細(xì)胞或組織勻漿液滴在蓋玻片上并在顯微鏡下觀察，如見(jiàn)細(xì)胞核周暈環(huán)(A shiny ring around the nuclei)或完整的細(xì)胞形態(tài)，說(shuō)明細(xì)胞仍完整。如果有70-80%的細(xì)胞均無(wú)核周暈環(huán)和完整細(xì)胞形態(tài)，說(shuō)明細(xì)胞已經(jīng)充分破碎，則進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。否則，重新勻漿10-30次直到細(xì)胞至少70%已經(jīng)破碎。同時(shí)記錄對(duì)于該細(xì)胞的勻漿次數(shù)，通常在后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)不必再摸索勻漿次數(shù)。另外需注意特定的勻漿次數(shù)和勻漿器也有關(guān)，需同時(shí)注意記錄使用的是哪一個(gè)勻漿器。

    注：如果沒(méi)有適當(dāng)?shù)牟Ａ�勻漿器，對(duì)于培養(yǎng)的細(xì)胞也可以采用凍融法來(lái)破碎細(xì)胞。把步驟2中的樣品在液氮和室溫依次反復(fù)凍融兩次，然后取少量樣品在顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞破碎的程度。如果細(xì)胞破碎的程度不足70%，可增加凍融次數(shù)，直到細(xì)胞破碎的程度大于70%。

4. 轉(zhuǎn)移裂解液到預(yù)冷的1.5ml離心管中，冰上放置10分鐘，期間劇烈渦旋2-3次，于4℃，16000rpm離心10min，棄沉淀，上清移至新的離心管中。

5.含上清的離心管37℃水浴10min，室溫，13000rpm離心5分鐘，樣品分成上層與下層（含膜蛋白）。

建議使用進(jìn)口的透明度高的離心管，方便觀察分層，在分層交界處有一折光線，需仔細(xì)觀察才可以見(jiàn)到。

6.  取下層，加入500ul冰冷滅菌水混勻，4℃放置5min后，置于37℃水浴10min。

7.  室溫，13000rpm離心5分鐘，樣品分成上層與下層（含膜蛋白）。

8. 重復(fù)第6,7步操作一次，最終取下層即為膜蛋白提取物。BCA法測(cè)定蛋白濃度。

9. 每100ul膜蛋白提取物加入900ul預(yù)冷的丙酮，混勻冰浴20min，16000rpm離心15min。

10. 棄上清，沉淀真空干燥或敞蓋冰浴10min，用含巰基乙醇或DTT適量的loading buffer溶解沉淀。如沉淀難以溶解，可以加入尿素或硫脲等強(qiáng)溶解力試劑。