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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

 活性氧檢測(cè)試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，也稱(chēng)ROS Assay Kit)試劑盒采用 DCFH-DA (2,7-dichlorofluorescin diacetate)探針?lè)椒ǎ�是迄今最常用、最靈敏的細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)探針。活性氧包括超氧自由基（O2•⁻）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥基自由基（•OH）、過(guò)氧亞硝基（ONOO−）、一氧化氮（•NO）等，它們參與了細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、發(fā)育分化、衰老和凋亡等許多生理和病理過(guò)程。 DCFH-DA 沒(méi)有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后可以被酯酶水解為不能透過(guò)細(xì)胞膜的 DCFH（dichlorofluorescin），當(dāng)活性氧存在時(shí)，DCFH 被氧化為強(qiáng)綠色熒光物質(zhì) DCF（dichlorofluorescein），熒光在激發(fā)波長(zhǎng) 502 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 530 nm 附近有最大波峰，熒光水平與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比。本試劑盒提供的活性氧檢測(cè)系統(tǒng)本底水平低，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

l    適用范圍：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、新鮮動(dòng)物組織

l  工作波長(zhǎng)：最佳激發(fā)波長(zhǎng) 500（500±15 nm），最佳發(fā)射波長(zhǎng) 525 (530±20nm)，也可按照 FITC 熒光檢測(cè)條件檢測(cè)

l    所需設(shè)備：流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)等

儲(chǔ)存和穩(wěn)定性:

-20℃避光凍存。本試劑盒自訂購(gòu)之日起一年內(nèi)有效。

試劑盒組成:

注意事項(xiàng)：

l  探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。

l  探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)的掃描和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描，以確認(rèn)探針的裝載情況是否良好。

l  盡量縮短探針裝載后到測(cè)定所用的時(shí)間(刺激時(shí)間除外)，以減少各種可能的誤差。

l  本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作

使用說(shuō)明：

一、 細(xì)胞樣本：

A．收集細(xì)胞，進(jìn)行活性氧測(cè)定

1.       細(xì)胞收集：

懸浮細(xì)胞：2000rpm，離心5min，收集沉淀，用 0.01M PBS 或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細(xì)胞沉淀；

貼壁細(xì)胞：吸去培養(yǎng)液，用0.01M PBS或無(wú)血清培養(yǎng)液反復(fù)吹打，使細(xì)胞層全部進(jìn)入 PBS 或培養(yǎng)液中，收集細(xì)胞懸液，用 0.01M PBS 或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細(xì)胞沉淀；

2.       DCFH-DA探針稀釋。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用無(wú)血清培養(yǎng)基或者PBS將DCFH-DA探針稀釋成工作液（提供的初始濃度為10mM）。

注意：DCFH-DA工作液濃度可在100 nM~20 μM范圍內(nèi)，需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最適濃度，一般情況下10 μM DCFH-DA工作液能取到理想效果。如要獲得10 μM DCFH-DA工作液10ml，取10μl M DCFH-DA (10mM)加入到10ml無(wú)血清培養(yǎng)或PBS中混勻即可。

3.       加入DCFH-DA探針，用稀釋好的 DCFH-DA 熒光探針重懸細(xì)胞沉淀，一般情況下，細(xì)胞密度要求1*10⁶-2*10⁷/ml。 并設(shè)置陰性與陽(yáng)性對(duì)照。

陰性對(duì)照：不加探針，只加入 PBS 或培養(yǎng)基的細(xì)胞。

陽(yáng)性對(duì)照：已加入DCFH-DA 熒光探針，并加入活性氧供體的細(xì)胞懸液，推薦試劑工作濃度0.1mM（該濃度可以根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整）。

4.       37℃孵育細(xì)胞20-60分鐘。通常情況下，20-30分鐘即可。

注意：孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類(lèi)型、刺激條件、DCFH-DA濃度等有關(guān)�？梢悦扛� 5min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

5.       1000g，離心5min，去上清收集細(xì)胞沉淀，用 PBS 緩沖液洗滌2次，重懸細(xì)胞。

6.       進(jìn)行熒光檢測(cè)，以熒光度數(shù)值表示結(jié)果。

B. 不收集細(xì)胞，直接將探針加入培養(yǎng)基測(cè)定

1.        DCFH-DA探針稀釋。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用無(wú)血清培養(yǎng)基或者PBS將DCFH-DA探針稀釋成工作液（提供的初始濃度為10mM）。

注意：DCFH-DA工作液濃度可在100 nM~20 μM范圍內(nèi)，需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最適濃度，一般情況下10 μM DCFH-DA工作液能取到理想效果。如要獲得10 μM DCFH-DA工作液10ml，取10μl M DCFH-DA (10mM)加入到10ml無(wú)血清培養(yǎng)或PBS中混勻即可。

2.        加入 DCFH-DA 探針，去除細(xì)胞培養(yǎng)基上清，加入稀釋好的 DCFH-DA 探針，加入探針的體積以能蓋住細(xì)胞為宜，通常 6 孔板單孔不少于 1ml。并設(shè)置陰性與陽(yáng)性對(duì)照。

陰性對(duì)照：不加探針，只加入培養(yǎng)基的細(xì)胞。

陽(yáng)性對(duì)照：已加入 DCFH-DA 熒光探針，并加入活性氧供體的細(xì)胞，推薦試劑工作濃度20-100 μM。

3.        37℃孵育細(xì)胞20-60分鐘。通常情況下，20-30分鐘即可。

注意：孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類(lèi)型、刺激條件、DCFH-DA 濃度等有關(guān)�？梢悦扛� 5min 顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

4.        棄去上層培養(yǎng)液，用無(wú)血清培養(yǎng)液或 0.01M PBS 反復(fù)吹打，使細(xì)胞層全部進(jìn)入 PBS 或培養(yǎng)液中。

5.        收集細(xì)胞懸液，用 0.01M PBS 或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，1000rpm，離心5min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細(xì)胞。

6.        進(jìn)行熒光檢測(cè)，以熒光度數(shù)值表示結(jié)果。

二、動(dòng)物組織樣本

1.        細(xì)胞懸液制備：可采用單細(xì)胞懸液制備儀或傳統(tǒng)的組織處理方法如：酶解法、研磨法等制備單細(xì)胞懸液；

2.        DCFH-DA探針稀釋。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用無(wú)血清培養(yǎng)基或者PBS將DCFH-DA探針稀釋成工作液（提供的初始濃度為10mM）。

注意：DCFH-DA工作液濃度可在100 nM~20 μM范圍內(nèi)，需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最適濃度，一般情況下10 μM DCFH-DA工作液能取到理想效果。如要獲得10 μM DCFH-DA工作液10ml，取10μl M DCFH-DA (10mM)加入到10ml無(wú)血清培養(yǎng)或PBS中混勻即可。

3.        加入 DCFH-DA 探針，用稀釋好的 DCFH-DA 熒光探針重懸細(xì)胞沉淀，并設(shè)置陰性與陽(yáng)性對(duì)照。

陰性對(duì)照：不加探針，只用0.01M PBS 重懸的細(xì)胞。

陽(yáng)性對(duì)照： 已加入 DCFH-DA 熒光探針，并加入活性氧供體的細(xì)胞懸液，推薦試劑工作濃度 20-100 μM。

4.        37℃孵育細(xì)胞20-60分鐘。通常情況下，20-30分鐘即可。

注意：孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類(lèi)型、刺激條件、DCFH-DA 濃度等有關(guān)�？梢悦扛� 5min 顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

5.        1000g，離心 5min，去上清收集細(xì)胞沉淀，用 PBS 緩沖液洗滌 2 次，重懸細(xì)胞.